ТЕМА: Стерилизация, асептика, антисептика, дезинфекция.
Принципы, методы культивирования микроорганизмов и выделения чистых культур.
Бактериологический метод исследования. 1 этап.
1. Ознакомиться с основными методами дезинфекции и стерилизации, применяемыми в микробиологии и медицине.
2. Знать особенности метаболизма микроорганизмов, принципы их культивирования в лабораторных условиях.
3. Освоить 1 этап бактериологического метода диагностики инфекционных заболеваний.
1. Методы, приборы и режимы стерилизации питательных сред, лабораторной посуды, медицинского инструментария.
2. Основные группы дезинфектантов, механизм их действия, область и способ применения.
3. Назначение питательных сред в микробиологической практике.
4. Принцип получения чистых культур микроорганизмов и сущность бактериологического метода, как «золотого стандарта» в диагностике инфекционных заболеваний.
5. Цель и последовательность выполнения 1 этапа бактериологического метода выделения чистых культур микроорганизмов.
1. Выбрать средства, режим стерилизации и дезинфекции в соответствии с конкретными задачами.
2. Охарактеризовать предложенные питательные среды, применяемые в микробиологической практике.
3. Провести 1 этап бактериологического метода выделения чистых культур аэробных микроорганизмов.
Контрольные вопросы:
1. Бактериостатическое и бактерицидное действие низких и высоких температур на микроорганизмы.
2. Влияние химических веществ различных классов на микроорганизмы. Антисептики и дезинфектанты.
3. Понятия: стерилизация, дезинфекция, асептика, антисептика.
4. Методы, аппаратура и режимы стерилизации, их выбор в зависимости от свойств стерилизуемого объекта.
5. Основные группы дезинфектантов и тактика их применения в ЛПУ.
6. Принципы и методы культивирования микроорганизмов.
7. Питательные среды: понятие; требования, предъявляемые к ним; классификация.
8. Понятие о виде, штамме, колонии, чистой культуре микроорганизмов.
9. Сущность бактериологического метода и области его применения.
10. Цель и последовательность выполнения 1 этапа бактериологического метода выделения аэробов.
Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):
1. Ознакомиться с приборами, используемыми для стерилизации в медицинской и микробиологической практике: паровой стерилизатор (автоклав), печь Пастера.
2. Выбрать приборы и режимы стерилизации питательных сред, лабораторной посуды, медицинского инструментария.
3. Ознакомиться с дезинфектантами, используемыми в медицинской и микробиологической практике. Выбрать дезинфектанты и режим дезинфекции для предлагаемых объектов.
4. Ознакомиться с различными питательными средами, применяемыми в микробиологической практике, дать их характеристику по составу, консистенции, назначению.
5. Провести 1 этап бактериологического метода выделения чистых культур аэробов:
5.1. Приготовить фиксированный препарат из исследуемого материала, окрасить по Граму, промикроскопировать и провести идентификацию выявленных микроорганизмов по морфологическим и тинкториальным свойствам.
5.2. Посеять исследуемый материал методом «штрих с площадкой».
5.3. Посеять исследуемый материал методом Дригальского (демонстрация).
6. Ознакомиться с набором средств для взятия и транспортировки патологических материалов.
Методические указания к выполнению исследовательского задания:
1. Знакомство с приборами, используемыми для стерилизации: паровой стерилизатор (автоклав), печь Пастера.
1.1. Паровой стерилизатор (автоклав) - стерилизация паром под давлением.
Наиболее надежным и универсальным методом стерилизации в медицинской и микробиологической практике является стерилизация паром под давлением. Производят ее в автоклаве, в котором стерилизуемые объекты нагревают насыщенным паром под давлением выше атмосферного. Между показаниями манометра и температурой насыщенного пара имеется следующая зависимость:
Нулевым давлением считают нормальное атмосферное давление (760 мм рт. ст.).
Стерилизация достигается только при полной исправности автоклава и правильной его эксплуатации специально обученным персоналом. Поэтому необходим постоянный контроль за режимом стерилизации, который производится физическим (термометр максимальный и др.), биологическим (биотест со спорами тест-культур микроорганизмов) и химическим (химические тесты, индикаторы типа ИС) способами.
Контроль режима стерилизации автоклавов проводят химическим способом при каждой загрузке автоклава. Химический тест – стеклянная трубочка с химическим веществом, имеющим определенную температуру плавления: антипирин, резорцин - 110±1°, бензойная кислота - 120±2°, бензамид - 126±1°, мочевина, никотинамид, Д (+)-манноза - 132±2°. В состав химических тестов вводят анилиновый краситель (фуксин, генцианвиолет и др.), который равномерно окрашивает вещество при его расплавлении. В настоящее время чаще используются индикаторы типа ИС (фирма «Винар», Россия), представляющие полоску бумаги с нанесенным на нее слоем индикаторной смеси и предназначенные для оперативного визуального контроля не только температуры, но и времени стерилизации (ИС-120, ИС-132). Ежеквартально проводится контроль режима стерилизации с использованием биотеста со спорами тест-культуры Bacillus stearotermophilus BKM B-718.
1.2. Печь Пастера – стерилизация сухим жаром.
В печи Пастера стерилизуют изделия из стекла, металлов и резин на основе силиконового каучука. Режим стерилизации: 160°С – 150 мин; 180°С – 60 мин. Контроль режима стерилизации при каждом цикле осуществляется с помощью индикаторов стерилизации ИС-160, ИС-180; ежеквартально - с использованием биотеста со спорами тест-культуры Bacillus licheniformis шт. G BKM B-1711 Д.
2. Заполнить дома таблицу №1.
Таблица 1.
Стерилизация
3. Ознакомиться с дезинфектантами и заполнить на занятии таблицу №2, используя приложения №1, 2.
Таблица 2.
Дезинфекция
4. Ознакомиться с питательными средами и заполнить на занятии таблицу №3 «Питательные среды».
Таблица 3.
5. Клиническая микробиология как раздел медицинской микробиологии решает две основные задачи: этиологическую диагностику инфекционного заболевания и рациональный выбор средств этиотропной терапии.
Основным методом микробиологической диагностики , позволяющим решить эти задачи, является бактериологический метод . Суть бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя, определение его вида и чувствительности к антимикробным препаратам.
Выбор исследуемого материала зависит от вида заболевания и преимущественной локализации возбудителя на определенном этапе его развития (патогенеза). Материалом может служить кровь, ликвор, раневое отделяемое, мокрота, испражнения, моча и т. д. Техника забора материала имеет большое значение в получении достоверного результата.
Успех выделения чистой культуры определяется правильностью выбора питательной среды и условий культивирования . Универсальной питательной среды, использование которой позволит выделить любые микроорганизмы из любого исследуемого материала, не существует. Поэтому с учетом физиологических особенностей возможных возбудителей заболевания производится посев материала на определенную питательную среду или комплекс питательных сред (специальные, элективные, дифференциально-диагностические). Для некоторых микроорганизмов требуются и особые условия культивирования (анаэробные, микроаэрофильные, с повышенным содержанием углекислоты).
Патологический материал от больного часто представляет смесь микроорганизмов. В этой связи задачей является их разобщение и получение изолированных колоний . Изолированная колония, как результат размножения одной микробной клетки и состоящая из одного вида клеток, является основой для получения чистой культуры. В микробиологической практике используют различные методы получения изолированных колоний. Наиболее чаще используются следующие:
1. Посев исследуемого материала методом «штрих с площадкой» – исследуемый материал наносят на поверхность плотной питательной среды на ограниченном участке, а затем распределяют путем посева частыми параллельными штрихами.
2. Метод Дригальского – материал, внесенный на первую чашку с питательной средой и посеянный с помощью шпателя, последовательно засевают тем же шпателем, не стерилизуя его, еще на 1-2 чашки.
3. Метод секторных посевов – исследуемый материал одной петлей засевают последовательно на несколько секторов. При этом определенная техника посева (метод Gould ) позволяет не только получить изолированные колонии, но и определить количество микроорганизмов в 1 мл (г) исследуемого материала, что имеет значение при оценке этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов (УПМ).
5.1.Проведение 1 этапа бактериологического метода выделения аэробов:
· из исследуемого материала приготовьте фиксированный препарат, окрасьте по методу Грама, промикроскопируйте, проведите идентификацию обнаруженных микроорганизмов по морфо-тинкториальным свойствам; обратите внимание на количество микроорганизмов. Результаты занесите в протокол и сделайте вывод;
· посейте исследуемый материал на половину чашки с плотной питательной средой методом «штрих с площадкой»;
· посейте исследуемый материал на три чашки с питательными средами методом Дригальского (демонстрация);
· подпишите чашки, указав дату посева, и поставьте их вверх дном в термостат при температуре 37° на 18-24 ч.
6. Средства для взятия и доставки патологического материала
Примечание:* - используют в случае, если сроки доставки материала в лабораторию после его получения превышают 1,5-2 ч.
Вопросы для самоконтроля:
1. Назовите и обоснуйте принципы культивирования микроорганизмов.
2. Почему при посеве патологического материала используются элективные, дифференциально-диагностические среды и среды накопления.
3. Обоснуйте принцип получения чистых культур микроорганизмов.
4. Почему бактериологический метод является «золотым стандартом» в микробиологической диагностике инфекционных заболеваний?
5. На чем основаны химические и биологические способы получения чистых культур микроорганизмов?
6. В чем состоит отличие стерилизации от дезинфекции?
7. Обоснуйте назначение стерилизации и дезинфекции в микробиологической и медицинской практике.
8. Обоснуйте преимущество использования термоиндикаторных систем при контроле режима стерилизации (на примере индикатора ИС фирмы «Винар», Россия).
Литература:
Учебники:
1. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М.: ООО «МИА», 2002. – С. 26-29, 63-66, 150-159.
2. Поздеев О. К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. - М.: ГЭОТАР Медицина, 2001. – С. 76-77, 126-130, 253-265.
Дополнительная литература:
1. Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности и гельминтами: Санитарные правила. – М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 1999. – 107с.
Лекции по микробиологии.
Тесты.
Бактериологический (культуральный) метод
совокупность методик искусственного культивирования микроорганизмов на питательных средах в целях их идентификации при установлении д-за инфекционного заболевания или иного вызванного микробами процесса и определения ряда физиологических св-в к-ры с др. целями, напр., при выборе химиотерапевтического препарата. Современные методы изучения большинства биол. св-в бактерий возможны только при наличии чистой к-ры (см.). Контаминация к-ры др. видом микробов, как правило, ведет к искажению результатов и неправильному заключению. Поэтому первой задачей Б.м. является получение чистой к-ры какого-либо вида (вара) из микробной ассоциации и предупреждение контаминации посторонней микрофлорой материала для исследования и микробной к-ры на всех этапах исследования. Это возможно при заборе материала в стерильных условиях в стерильную посуду, посеве материала в стерильные среды стерильным инструментом, предупреждении попадания микробов из воздуха в процессе доставки, хранения и инкубации материала и засеянных питательных сред. Вторая задача Б.м. - идентификация микробов (см.) выделенной чистой к-ры, третья - определение дополнительных св-в, напр., чувствительности к антибиотикам, вирулентности. Этапы Б.м.: 1) забор материала (см. Материалы для исследования) и его доставка в бактериол. лабораторию; 2) микроскопия иссл. материала (см. Бактериоскопический метод). Этот этап часто не выполняется, хотя, несмотря на меньшую чувствительность, предварительная микроскопия в ряде случаев дает ориентировочные сведения о возбудителе и позволяет выбрать необходимые для посева среды; 3) обработка иссл. материала физ. или хим. факторами в целях удаления или уменьшения посторонней микрофлоры. Эта мера применяется, напр., при исследовании мокроты, выделении кислотоустойчивых и спорообразующих микробов; 4) посев иссл. материала (см. Посевы бактериологические) на питательные среды для получения изолированных колоний; 5) инкубация засеянных питательных сред. Сроки и температура инкубации зависят от предполагаемой видовой принадлежности к-ры. Обычно посевы выдерживают в термостате при 37°С 1-2 дня. Если рост отсутствует, срок инкубации может быть продлен еще на 2 - 3 дня. При более длительной инкубации необходимо предупредить высыхание среды, для чего посевы помещают в эксикатор с водой или пробки пробирок заливают парафином; 6) исследование колоний (см.). Для изучения выбирают однородные изолированные колонии, располагающиеся далеко от краев чашки и по штриху петли, окружают их чертой, нумеруют. Если исследование ведется ненаправленно (полиэтиологичный процесс и пр.), то на основании результатов визуального осмотра выбирают по 2 - 3 колонии всех имеющихся на чашке типов и делают с них мазки; 7) пересев с выбранных колоний на среды накопления. Для этого с остатка колонии, в мазке к-рой выявлены однородные по форме и окраске бактерии, петлей, стараясь не задеть соседние колонии, забирают часть к-ры и засевают на скошенный в пробирке МПА или специальную среду штрихом; 8) инкубация посевов в термостате до появления сплошного роста (обычно 1 -2 дня); 9) определение чистоты выросшей на скошенных средах к-ры путем макроскопического осмотра роста и микроскопии мазка из него; 10) идентификация выделенной чистой к-ры и в случае необходимости (по требованию клинициста, эпидемиолога) определение различных биол. св-в; 11) заключение о видовой принадлежности выделенной к-ры и ее св-вах. Заключение дается на официальном бланке со ссылкой на номер, под крым эта к-ра занесена в лабораторный журнал. Б.м. является основным в д-ке большинства бактер. инфекций. Он, как правило, обладает высокой чувствительностью, позволяющей выделить из, иссл. материала чистую к-ру, даже если в посевной дозе материала содержалось несколько десятков особей. Для Б.м. характерна высокая специфичность. Выделение того или иного вида бактерий из патологического материала при соблюдении ряда условий (см. Возбудитель болезни) надежно устанавливает этиологию патологического процесса. Исключение составляют условно-патогенные аутохтонные для того или иного биотопа бактерии, для определения этиол. роли к-рых нужны специальные критерии, а также разграничение носительства и заболевания (напр., дифтерийное носительство при стрептококковой ангине). Ценность Б.м. состоит также в том, что с его помощью могут быть установлены св-ва к-ры, необходимые для назначения химио- и серотерапии, выявления источника инфекции и механизмов передачи возбудителя, выбора противоэпидемических мероприятий. Наконец, Б.м. относится к ранним методам д-ки. Недостатки Б. м. - опасность инфицирования, сложность, трудоемкость, длительность. Достоверные данные о составе микрофлоры и ее св-вах можно получить только при исследовании выборки из 3 -10 к-р.
Культуральный (бактериологический) метод исследования - совокупность способов, направленных на выделение и идентификацию чистых культур микроорганизмов (бактерий) с помощью культивирования на питательных средах.
Чистая культура - совокупность микроорганизмов одного вида. Чаще всего чистую культуру получают путем отбора и культивирования изолированной колонии (потомство одной микробной клетки).
Этапы метода:
1. Забор материала для исследования.
2. Выделение чистой культуры и ее идентификация.
3. Заключение.
Забор материала для исследования. Вид исследуемого материала зависит от цели исследования (диагностика - от больного; эпиданализ - из внешней среды, продуктов питания, больного и (или) бактерионосителя).
Выделение чистой культуры . Включает 3 или 4 этапа:
1. Посев материала (после предварительной микроскопии) на чашку с плотной питательной средой (лучше дифференциально-диагностической или селективной) с целью получения изолированных колоний. Производят его чаще всего методом механического разобщения. В некоторых случаях (например, кровь) материал предварительно засевают в жидкую среду обогащения с последующим пересевом на чашку с агаровой средой. Иногда до посева проводят селективную обработку материала (с учетом свойств выделяемого микроорганизма; например, обработка кислотой или щелочью для выделения устойчивых бактерий). Культивируют при температуре 37°С в течение 18-24 часов. Время культивирования для разных видов бактерий может колебаться.
2(3):а) изучение колоний на чашке с агаром (культуральные признаки), отбор наиболее типичных; б) приготовление мазков из этих колоний с окраской (по Граму или другими методами); а) отсев остатка исследованной колонии на среду накопления и выращивание в термостате при оптимальной температуре.
3(4). Изучение чистоты культуры, полученной на среде накопления. С этой
целью готовят мазок, окрашивают (чаще по Граму), микроскопически изучают
морфологическую и тинкториальную однородность (в разных полях зрения).
4(5). Идентификация чистой культуры.
Заключение. По совокупности признаков в сравнении со свойствами эталонных (типовых) штаммов указывается вид выделенного из материала микроорганизма.
Оценка метода:
достоинства: относительно высокая чувствительность и точность, возможность определить численность микробов в исследуемом материале, а также чувствительность к антибиотикам; недостатки: относительная длительность, метод дорогостоящий.
21. Питательные среды для аэробов и анаэробов. Требования, предъявляемые к питательным средам, классификация.
Требования:
1. среды должны быть питательными
2. должны иметь определенные ph
3. должны быть изотоническими, т.е. осмотическое давление в среде должго быть такое же как в клетке.
4. должны быть влажными и не слишком жидкими
5. должны облпдпть определенным окислительно-восстановительным потенциалом
6. должны быть стерильными
7. должны быть унифицированными, т.е. содержать постоянные количества отдельных ингредиентов.
Питательные среды можно разделить:
А) По происхождению:
1} естественные - натуральные продукты питания (мясо, молоко, картофель);
2) искусственные - приготовленные специально для выращивания микробов: - среды из естественных продуктов (мясная вода, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), - не имеющие постоянного состава; - синтетические питательные среды - растворы строго определенных количеств солей, аминокислот, азотистых оснований, витаминов в дистиллированной воде - имеют постоянный состав, используются для выращивания микроорганизмов и культур клеток при получении вакцин, иммунных сывороток и антибиотиков;
Б) По назначению:
1) общего назначения (МПБ, МПА) - на них растет большинство микробов;
2) элективные - избирательно способствуют росту одного вида микробов из смеси (например, желточно-солевой агар для стафилококков);
Бактериологический метод исследования (БЛМИ) – метод, основанный на выделении чистых культур бактерий с помощью культивирования на питательных средах и их идентификации до вида на основании изучения морфологических, культуральных, биохимических, генетических, серологических, биологических, экологических характеристик микроорганизмов.
Бактериологическую диагностику инфекций проводят, используя стандартные диагностические схемы, утвержденные Министерством здравоохранения.
Чистая культура – бактерии одного вида, выращенные на питательной среде, свойства которых находятся в процессе изучения.
Штамм – идентифицированная чистая культура микроорганизмов одного вида, выделенная из определенного источника в определенное время. Штаммы одного вида могут несущественно отличаться биохимическими, генетическими, серологическими, биологическими и др. свойствами, а также местом и временем выделения.
Цели БЛМИ:
1. Постановка этиологического диагноза: выделение чистой культуры микроорганизмов и её идентификация.
2. Определение дополнительных свойств, например, чувствительности микроорганизма к антибиотикам и бактериофагам.
3. Определение количества микроорганизмов (важно в диагностике инфекций, вызываемых УПМ).
4. Типирование микроорганизмов, т. е. определение внутривидовых различий на основании изучения генетических и эпидемиологических (фаговаров и сероваров) маркёров. Это используется в эпидемиологических целях, т. к. позволяет установить общность микроорганизмов, выделяемых от разных больных и из разных объектов внешней среды, в различных стационарах, географических регионах.
БЛМИ включает несколько этапов, различных для аэробов, факультативных анаэробов и облигатных анаэробов.
I. Этапы БЛМИ при выделении чистой культуры аэробов и факультативных анаэробов.
Этап.
А.Забор, транспортировка, хранение, предварительная обработка материала. Иногда до посева проводят селективную обработку материала с учетом свойств выделяемого микроорганизма. Например, перед исследованием мокроты или другого материала на присутствие кислотустойчивых микобактерий туберкулеза, материал обрабатывают растворами кислот или щелочей.
Б. Посев в среду обогащения (при необходимости).Его проводят, если в исследуемом материале содержится малое количество бактерий, например, при выделении гемокультуры. Для этого кровь, взятую на высоте лихорадки в большом объёме (8–10 мл у взрослых, 4–5 мл у детей) засевают в среду в соотношении 1:10 (для преодоления действия бактерицидных факторов крови); посев инкубируют при температуре 37 0 С 18-24 ч.
В. Микроскопия исследуемого материала. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают его по Граму или другим методом и микроскопируют. Оценивают присутствующую микрофлору, ее количество. В ходе дальнейших исследований должны быть выделены микроорганизмы, присутствовавшие в первичном мазке.
Г. Посев на питательные среды с целью получения изолированных колоний. Производят посев материала петлёй или шпателем методом механического разобщения на чашку с дифференциально-диагностической или селективной средой с целью получения изолированных колоний. После посева чашку переворачивают дном кверху (чтобы избежать размазывания колоний капельками конденсационной жидкости), подписывают и помещают в термостат при температуре 37 0 С на 18-24 ч.
Следует помнить, что при посевах и пересевах микробных культур внимание работающего должно быть обращено на соблюдение правил асептики для предупреждения контаминации питательных сред и предупреждения заражения окружающих и самозаражения!
В случае инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, где имеет значение количество присутствующих микроорганизмов в патологическом материале, делают количественный посев материала, для чего предварительного готовят ряд 100-кратных разведений материала (обычно 3 разведения) в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия в пробирках. После чего по 50 мкл каждого разведения высевают на питательные среды в чашках Петри.
Этап.
А. Изучение морфотипов колоний на средах, их микроскопия. Просматривают чашки и отмечают оптимальную питательную среду, скорость роста, характер роста микроорганизмов. Для изучения выбираютизолированные колонии, расположенные по ходу штриха, ближе к центру. Если вырастает несколько типов колоний – каждый исследуется в отдельности. Оценивают признаки колоний (табл. 7). При необходимости чашки с посевамипросматривают через лупу или с помощью микроскопа с объективом малого увеличения и суженной диафрагмой. Изучают тинкториальные свойства отличающихся морфотипов колоний, для этого из части исследуемой колонии готовят мазок, окрашивают по Граму или другими методами, микроскопируют и определяют морфологию чистоту культуры.При необходимости ставят ориентировочную РА на стекле с поливалентными сыворотками.
Б. Накопление чистой культуры. Для накопления чистой культуры изолированные колонии всех морфотипов пересевают в отдельные пробирки со скошенным агаром или какой-либо другой питательной средой и инкубируют в термостате при +37 0 С (такая температура оптимальна для большинства микроорганизмов, но может быть и другой, например, для Campylobacterium spp. – +42 0 C, Candida spp. и Yersinia pestis – +25 0 C).
В качестве среды накопления для энтеробактерий обычно используют среду Клиглера.
Состав среды Клиглера: МПА, 0,1% глюкозы, 1% лактозы, реактив на сероводород (сернокислое железо + тиосульфат натрия + сульфит натрия), индикатор феноловый красный. Изначальный цвет среды малиново-красный, среда «скошена» в пробирках: имеет столбик (2/3) и скошенную поверхность (1/3).
Посев в среду Клиглера производится штрихом по поверхности и уколом в столбик.
Этап.
А. Учет роста на среде накопления, оценка чистоты культуры в мазке по Граму.Отмечают характер роста выделенной чистой культуры. Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследовании окрашенного мазка, приготовленного из такой культуры, в нём в разных полях зрения обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки. Однако в случае выраженного плеоморфизма, присущего некоторым видам бактерий, в мазках из чистой культуры могут встречаться одновременно клетки с различной морфологией.
Если в качестве среды накопления использовали индикаторную среду Клиглера, то оценивают изменения ее цвета в столбике и скошенной части, по которым определяют биохимические свойства: ферментацию глюкозы, лактозы и продукцию сероводорода. При разложении лактозы желтеет скошенная часть среды, при разложении глюкозы – желтеет столбик. При образовании CO 2 в процессе разложения сахаров образуются газовые пузырьки или разрыв столбика. В случае продукции сероводорода отмечается почернение по ходу укола из-за превращении сульфата железа в сульфид железа.
Характер изменения цвета среды Клиглера (рис. 23) объясняется неодинаковой интенсивностью расщепления микроорганизмами азотистых веществ и образования щелочных продуктов в аэробных (на скошенной поверхности) и анаэробных (в столбике) условиях.
В аэробных условиях на скошенной поверхности происходит более интенсивное щелочеобразование, чем в столбике среды. Поэтому при разложении глюкозы, присутствующей в среде в небольшом количестве, образующаяся на скошенной поверхности кислота быстро нейтрализуется. В то же время при разложении лактозы, присутствующей в среде в высокой концентрации, щелочные продукты не способны нейтрализовать кислоту.
В анаэробных условиях в столбике щелочные продукты образуются в ничтожном количестве, поэтому здесь выявляется ферментация глюкозы.
Рис. 23. Индикаторная среда Клиглера:
1 – исходная,
2 – с ростом E. coli,
3– с ростом S. paratyphi B,
4 –с ростом S. typhi
E. coli разлагают глюкозу и лактозу с газообразованием, не продуцируют сероводород. Они вызывают пожелтение столбика и скошенной части с разрывами среды.
S. paratyphi разлагают глюкозу с газообразованием, лактозоотрицательны. Они вызывают пожелтение столбика с разрывами, скошенная часть не изменяет цвет и остается малиновой. При этом S. paratyphi B продуцируют сероводород (по ходу укола появляется черная окраска), S. paratyphi A сероводород не продуцируют.
S. typhi разлагают глюкозу без газообразования, лактозоотрицательны, продуцируют сероводород. Они вызывают пожелтение столбика без разрывов, скошенная часть не изменяет цвет и остается малиновой, по ходу укола появляется черная окраска.
Shigella spp. глюкозопозитивны, лактозоотрицательны, не продуцируют сероводород. Они вызывают пожелтение столбика (с разрывами или без них в зависимости от серовара), скошенная часть не изменяет цвет и остается малиновой.
Б. Окончательная идентификация чистой культуры (определение систематического положения выделенного микроорганизма до уровня вида или варианта) и определение спектра чувствительности выделенной культуры к антибиотикам.
Для идентификации чистой культуры на этом этапе изучают биохимические, генетические, серологические и биологические признаки (табл. 8).
В рутинной лабораторной практике при идентификации нет необходимости изучать все свойства. Используютинформативные, доступные, простые тесты, достаточные для определения видовой (вариантной) принадлежности выделенного микроорганизма.
В соответствии с современными программами ВОЗ, основой выявления туберкулёза за рубежом считают проведение микроскопии мазков мокроты, полученной от кашляющих больных, обратившихся к врачам общей практики; мазки окрашивают по Цилю-Нильсену. Эта методика входит в отечественный поликлинический и клинический минимум обследования пациента, выделяющего мокроту. В 1995 г. Минздравмедпром России в приказе № 8 "О развитии и совершенствовании деятельности лабораторной клинической микробиологии (бактериологии) лечебно-профилактических учреждений" подтвердил эту обязанность клинико-диагностических лабораторий. Обязательное бактериологическое исследование мокроты на М. tuberculosis должно быть организовано для нетранспортабельных больных, больных хроническими заболеваниями органов дыхания и мочевыводящей системы, а также для работников неблагополучных по туберкулёзу животноводческих хозяйств. Этот старейший метод полностью сохраняет свое значение вследствие доступности для практических клинико-диагностических лабораторий, низкой стоимости и быстроты выполнения.
При бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены при наличии не менее 100 000 - 1 000 000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала (мокроты). Такое большое количество микобактерий встречается у больных с далеко зашедшими прогрессирующими формами заболевания (диссеминированными и фиброзно-кавернозными). У значительно большего числа больных количество выделяемых ими микобактерий ниже предела метода бактериоскопии, что и является большим минусом этого метода. Только при идеальном выполнении всех требуемых условий, указанных в Приказе № 109 МЗ РФ,-исследование не менее трех проб диагностического материала, правильный сбор мокроты, наличие современного бинокулярного микроскопа и высококачественных реактивов, просмотр до 300 полей зрения - возможно повышение чувствительности до 10000 микробных клеток.
Микобактерии туберкулёза имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины с утолщениями на концах или посередине, располагаются группами и поодиночке (рисунок 1,а) Окрашенные по Цилю-Нильсену мазки микроскопируют с иммерсионной системой не менее 10 мин.
Люминесцентная микроскопия
Метод основан на проникновении в микробную клетку карболового производного флюоресцентного красителя (аурамина, родамина). При окраске флюоресцентным красителем аурамином-родамином микобактерии можно видеть при неиммерсионном 100-кратном увеличении. Более точен результат при окраске по Цилю-Нильсену карболфуксином и иммерсионной микроскопии при 1000-кратном увеличении. Именно окраска мазка по Цилю-Нильсену рекомендована при применении технологий DOTS. Микобактерии в этом случае выглядят светящимися желтыми палочками (рисунок 1, б). Метод имеет неоспоримые преимущества, так как позволяет при меньшем увеличении микроскопа просмотреть фактически весь мазок, так же этот метод экономически более эффективен, так как уменьшается время, затрачиваемое на просмотр мазков.
К недостаткам метода ЛМ следует отнести значительно более высокую стоимость люминесцентного микроскопа, при процедуре окрашивания- соблюдение и коррекция pH мазка, а также освобождение микобактерий в диагностическом материале (особенно в мокроте) от окружающей их слизи, которая препятствует проникновению флуоресцентного красителя в микробную клетку. Поэтому нецелесообразно использование ЛМ для нативной мокроты, но применять этот метод рекомендуется при исследовании мазков, приготовленных после центрифугирования из осадка материала, обработанного для культурального исследования и нейтрализованного после деконтаминации. Поэтому метод ЛМ следует применять в бактериологических лабораториях, где культуральное и микроскопическое исследование может быть произведено из одной и той же порции диагностического материала.
При гистологическом или цитологическом исследовании иногда можно обнаружить характерные для туберкулёза клетки, являющиеся результатом защитной реакции организма на внедрение туберкулёзной палочки. Наличие в цитограмме гигантских клеток Лангханса с несомненностью решает диагноз туберкулёза. Эти клетки имеют очень большие размеры (80 - 90 мкм и более в диаметре). Цитоплазма окрашена в серо-голубой цвет. По её периферии расположено в ряд большое количество ядер (до 20), расположенных в форме кольца (рисунок 1, в).
Другим признаком туберкулёза является присутствие в препарате так называемых эпителиоидных клеток, из которых и развиваются клетки Лангханса. Это происходит при увеличении количества ядер без разделения цитоплазмы, которая только увеличивается в размерах (рисунок 1, г).
Микроскопия позволяет быстро получить результат, но обладает низкой чувствительностью и специфичностью, невозможностью дифференциации кислотоустойчивых микобактерий.
Рисунок 1 - Микобактерии туберкулеза
а - метод окраски по Цилю-Нельсену
б - метод люминисцентной микроскопии
в - клетки Лангхаса
г - эпителиоидные клетки
Культуральный метод
Наиболее распространенным методом выявления микобактерий туберкулеза в нашей стране является культуральный метод. Это "золотой стандарт" бактериологической диагностики туберкулеза, так как чувствительность метода существенно выше микроскопического и дает возможность получить чистую культуру микобактерий для её последующей идентификации и исследования лекарственной устойчивости. Этот метод дает положительные результаты при наличии в исследуемом материале от 20 до 100 жизнеспособных микробных клеток в 1 мл. Однако он трудоемок и длителен в связи с тем, что микобактерии туберкулеза растут очень медленно и их обнаружение может быть зарегистрировано только через 3 недели культивирования.
Исторически сложилось, что питательные среды на яичной основе (Левенштейна-Йенсена, Финна-2, Огавы, Аникина, "Новая", Попеску) получили наибольшее распространение среди плотных питательных сред, применяемых для выделения МБТ. Посев материала на среду Левенштайна-Йенсена проводят в бактериологической лаборатории. Рост первых колоний на классических средах отмечают через 4 - 8 недель. Однако появившиеся в последние годы агаровые среды Миддлбрука (7Н10, 7Н11) позволяют быстрее обнаружить рост микобактерий (от двух до четырех недель) и обеспечивают лучшие возможности для изучения морфологии колоний, чем на яичных средах. Недостатком агаризованных питательных сред является необходимость инкубации посевного материала в термостате с углекислым газом, поэтому агаризованные среды в России практически не применяются.
Следует отметить, что в связи с высокой избирательностью различных штаммов микобактерий и потребностью в полноценных белках до сих пор нет универсальной питательной среды , способной заменить все остальные. В Приказе № 109МЗ РФ для посева диагностического материала на МБТ рекомендуется использовать по одной пробирке международной питательной среды Левенштейна-Йенсена и Финна-2. Однако практика показывает, что кроме указанных сред целесообразно использовать и какую-либо из дополнительных, а посев на три пробирки питательной среды также повышает эффективность культуральной диагностики.
Для полноценной культуральной диагностики туберкулеза необходимо иметь соответствующие помещения и оборудование. Особенно важно наличие центрифуги и антиаэрозольной защитой и способностью обеспечить ускорение 3000g. А также шкафов биологической безопасности для предотвращения внутрилабораторного инфицирования.
Основным недостатком культуральной диагностики туберкулеза является длительность исследования - от трех недель до трех месяцев. Поэтому остаются актуальными дальнейшие исследования по разработке методов ускорения роста микобактерий.
Системы BACTEC
Культуральная диагностика туберкулеза переживает в настоящее время принципиальные изменения, связанные с внедрением в практику полностью автоматизированных систем культивирования МБТ. Главное отличие этих методов - применение жидких питательных сред для культивирования с последующей радиометрической (BACTEC 460), колорометрической (Mb-Bact, Вас- tALERT) и люминесцентной детекцией роста (BACTEC MGIT 960). Рост МБТ на жидкой питательной среде в этих системах удается обнаружить уже через 1 - 2 недели в зависимости от их исходного количества в диагностическом материале. Частота выявления микобактерий так же несколько выше, чем на плотных питательных средах. Автоматизированные системы BACTEC с использованием соответствующих флаконов, содержащих различные противотуберкулезные препараты, позволяют сократить время исследования лекарственной устойчивости микобактерий до 10 - 14 суток.
Из перечисленных автоматизированных систем наиболее эффективна в настоящее время система BACTEC MGIT 960BD. Флаконы MGIT с жидкой питательной средой 7Н9 содержат в придонной части под силиконом флуоресцентный индикатор, "погашенный" высокими концентрациями кислорода. При наличии роста микобактерий в процессе поглощения кислорода индикатор начинает светиться, регистрация флуоресценции в сисиеме BACTEC MGIT производится автоматически. Использование флаконов MGIT возможно и "вручную", тогда регистрацию свечения производят с помощью трансиллюминатора на флаконах MGIT составляет 11 суток.
